光合作用包括光反应和暗反应。在光反应中，通过电子传递链将光能转化成化学能储藏在ATP；在暗反应中，利用光反应获得的能量，通过三碳途径（C3植物）或四碳途径（C4植物）将C02还原成碳水化合物。除草剂主要通过以下途径来抑制光合作用：抑制光合电子传递链、分流光合电子传递链的电子、抑制光合磷酸化之抑制色素的合成和抑制水光解。
抑制光合电子传递链 约有3 0%的除草剂是光合电子传递抑制剂，如三氮苯类、取代脲类、脲嘧啶类、双氨基甲酸酯类、酰胺类、二苯醚类、二硝基苯胺类。作用位点在光合系统Ⅱ和光合系统I之间，即QA和PQ之间的电子传递体B蛋白，除草剂与该蛋白结合后，改变它的结构，抑制电子从QA传递到PQ，使得光合系统处于过度的激发态，能量溢出到氧或其他邻近的分子，发生光氧化作用，最终导致毒害。
分流光合电子传递链的电子 联吡啶类除草剂百草枯和敌草快等是光合电子传递链分流剂。它们作用于光合系统I，截获电子传递链中的电子而被还原，阻止铁氧化还原蛋白的还原及其后的反应。这类除草剂杀死植物并不是直接由于截获光合系统l的电子造成的，而是由于还原态的百草枯和敌草快自动氧化越
程中产生过氧根阴离子导致生物膜中未饱和脂肪酸产生过氧化作用，破坏生物膜的半透性，造成细胞的死亡。
抑制光合磷酸化 到目前为止，初始作用是直接抑制光合磷酸化的除草剂还没有商品化。但有些电子传递抑制剂如二苯醚类、联吡啶类和敌稗等，在高浓度下也能抑制光合磷酸化，使得ATP合成停止。
抑制色素合成 在类囊体膜上，有大量的叶绿素和类胡萝卜素。这两类色素紧密相连，前者收集光能，后者则保护前者免受氧化作用的破坏。抑制这两类色素中任何一种的合成，将导致植物出现白化现象。有多种除草剂如吡氟酰草胺、氟啶草酮、苯草酮、苄胺灵、异噁草酮抑制类胡萝卜素生物合成，大多数是抑制去饱和酶（八氢番茄红素去饱和酶和5一胡萝卜素去饱和酶）。异噁草酮不抑制去饱和酶，其作用位点在异戊烯焦磷酸与拢牛儿基焦磷酸之间。类胡萝卜素合成受阻导致叶绿素遭到破坏，植物出现白化现象。
最新的研究证明，一些除草剂如二苯醚类除草剂和噁草灵，直接抑制叶绿素的生物合成，其作用靶标酶是原卟啉原氧化酶'导致原卟啉Ⅸ合成受阻，从而抑制叶绿素的合成。